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Cruiser®基因敲除检测试剂盒

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❀产品概要
Cruiser® 基因敲除检测试剂盒是一款简便高效的基因敲除和基因多态性检测试剂盒,该试剂盒的核心成分是Cruiser®基因敲除检测错配酶,它是一种具天然强活性的核酸内切酶,与CelⅠ同源。该酶能够高效特异地识别异源双链DNA的突变位点,并从突变位点的3’-端高效地切割异源双链DNA。Cruiser®基因敲除检测试剂盒广泛应用于精确检测人、哺乳动物、细菌、真菌、病毒以及植物基因的敲除,尤其适用于CRISPR/Cas9技术、TALENs技术和ZFNs技术的基因敲除研究。 
 
❀产品优势  

●检测速度快:只需5~20 min,便可检测到各种类型的碱基突变,如:碱基替换、插入和缺失等;

●操作方便:无需胶回收纯化,PCR产物直接进行酶切验证;

●特异性高:精准切割突变位点,识别范围最小为1 bp的突变位点,最大可达上百bp的突变序列;

●检测方便:酶切后的PCR产物,可以通过常规琼脂糖凝胶电泳快速检测;

●混合样本分析:酶切分析混合样品(cell pool)的PCR产物,根据电泳结果计算突变率;

●高通量筛选:更加轻松地从大量样本中筛选阳性克隆。  



❀应用方向 

●用于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9实验中混合样品的敲除效率的检测;

●用于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9实验中阳性克隆的筛选。


❀产品规格

Cat.No.

产品名称

规格

GP0102  

Cruiser®基因敲除检测试剂盒

25次  

GP0103  

Cruiser®基因敲除检测试剂盒

100次


阳性对照DNA  为杂交后的DNA片段,经Cruiser®基因敲除检测错配酶切割后形成三个明显片段,分别为393 bp、134 bp、259 bp,其中134  bp和259 bp片段是酶切后片段,而393 bp片段为杂交形成的homo-duplex  DNA片段,无酶切割位点,因此片段大小不变(Figure1.)。

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Figure 1.  阳性对照和Pool检测的电泳结果       Figure 2. K562细胞中Atg10基因敲除案例

上图中,M:100 bp-DNA  Marker;   Positive:阳性对照DNA;   Pool:混合克隆;   Clone1-7:单克隆。  


A.  混合样本分析:  

根据酶切后条带的亮度大致估测敲除效率,并送测序验证。因不同宿主物种中敲除载体的转染效率的差异,Pool验证阳性的可能性也会有较大差异,甚至存在Pool验证显示阴性,但最终却筛选到阳性克隆的情况,一般地,被转染的细胞比例越高,Pool检测越容易进行(见Figure1.)。  


B.  单克隆结果分析

如上图Figure2.所示为杂交后直接酶切的结果:clone3,5和6为潜在的阳性克隆,后续直接进行TA克隆和测序验证等位基因突变情况。  

进一步对上述阴性单克隆间进行两两杂交反应(例如clone1与2杂交,clone4与7杂交……),再进行酶切,步骤如前述,然后再次电泳检测,结果分析如下:  

①若电泳结果显示阴性,则可判定Clone A与Clone  B均为野生型,即未敲除(当然不排除Clone A与Clone B均为纯合突变型且突变后序列完全一致,但几率较小,几乎为零,所以不考虑)。

②若电泳结果显示阳性(经验证明,这种情况几率也不是很大,此步骤能帮助筛选出两个亲本完全相同的敲除),则说明Clone  A与Clone B中至少有一个为两个亲本相同KO情况的纯合突变型,此时可将Clone A、Clone  B分别与野生型杂交,再进行一轮酶切验证即可,阳性克隆送测序验证突变情况。

GP0102,GP0103-Cruiser基因敲除检测试剂盒说明书.pdf


Q&A

Q-1:PCR 反应后,电泳检测条带不亮,或者有杂带怎么办?

A-1:建议在正式实验前先摸索好引物的PCR条件。

①若条带不亮,则更换引物,若是因为基因本身的序列问题(如GC含量高),无法找到合适的引物, 则取第一轮PCR产物1μL,以30μL体系扩增第二轮(见下图Figure 4.),再用二轮产物进行后续的酶切实 验。或者适当增加PCR循环数,比如40 cycles。

②若有杂带,则更换引物,若是因为基因本身的序列问题(如特异性较低),无法找到合适的引物,此 时若杂带的大小与Cruiser®基因敲除检测错配酶酶切后产生的片段大小不同,则可以直接酶切(见下图Figure 5中红箭头处的条带大小则为杂带,而它与下端的酶切条带大小不一致,不影响判断)。

③若没有条带,则需要确认细胞是否为该物种名称的细胞,若用其它该物种的引物可以PCR出正确大 小的条带,则可以排除细胞错误的可能,需重新设计PCR用引物,或者尝试使用其它公司的高保真酶。

Figure 4.扩增获得目的片段一轮PCR(上)和二轮PCR(下)电泳图

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Figure 5. PCR扩增目的片段有杂带,但不影响酶切的酶切电泳图


Q-2:酶切后,电泳结果仅有原片段而无酶切条带?
A-2:请先确定 Marker 是否明亮,阳性对照是否正常(阳性对照正常电泳图详见结果分析),未酶切前原PCR 片段是否明亮?若是因为以上原因造成酶切结果异常(无酶切条带、酶切条带较弱),请先按下图予以纠正。
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在 Marker 明亮,阳性对照明亮且已被切开,样品原条带明亮的情况下,样品没有酶切条带,则造成该 实验结果有以下几种可能:
a.样品均为阴性,即 DNA 片段中无突变位点,可重新进行上游实验,也可通过对该 DNA 片段 进行测序验证;
b.PCR 产物没有进行杂交,请检查反应底物是否经过杂交 DNA 步骤。
c.所使用 PCR 用酶体系与Cruiser®基因敲除检测错配酶反应体系冲突,建议选购Cruiser®基因敲除检测试剂盒。
d.DNA 片段中杂交 DNA 含量过低,致使反应后条带不易观察到。此情况应优先考虑改善杂交 条件,杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下,有条件的可使用金属浴或水浴退火。


 

Q-3:酶切后,电泳结果中原片段明亮但酶切条带较弱?
A-3:在 Marker 明亮,阳性对照明亮且已被切开,样品原条带明亮的情况下,样品酶切条带较弱,则可能是因为样品 DNA 片段中杂交 DNA 含量过低。该情况也常见于 cell pool 检测中,因 cell pool 中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低,导致获得 DNA 片段中杂交 DNA 含量 过少。此时建议加大底物量(10μL 的酶切体系所加的底物量最多不超过 7μL,所用Cruiser®基因敲除检测错配酶 1μL 量不变) 对于单克隆筛选中出现此中情况,应优先考虑改善杂交条件,杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下,有 条件的可使用金属浴或水浴退火。
  
Q-4.酶切后,电泳结果酶切条带轻微弥散?
A-4:该现象可能原因如下:
当酶切后条带<200 bp,且经较长时间的核酸电泳,条带宽度变大,亮度不足时呈现类似弥散的带型; 当突变位点过长,尤其当突变长度达到 50 bp 以上时,酶切后条带易出现弥散现象,此时弥散程度会因酶 切后条带大小的不同而不同,片段越小弥散情况越明显。
原因可能如下:
 a.酶切后条带较小,在电泳时导致条带宽度变大造成弥散,使用更高浓度的琼脂糖凝胶,如 2%等;
 b.琼脂糖凝胶放置过久,推荐使用新配置的胶;
 c.样品有核酸酶污染;
 d.反应体系中 Mg2+的含量不足时,此时可以每 10μL加入 3μL Cruiser® 缓冲溶液(5x);
 e.酶切反应结束要先等 PCR 仪温度降到 4℃后立即拿出加 2μL 终止缓冲溶液(6x),随后立刻进行琼脂糖凝
胶电泳检测或置于-20℃保存。

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Q-5:酶切后,电泳结果中酶切条带大小不是预期大小?
A-5:出现该情况表明制备的 DNA 片段中含有其他杂交位点,可能性如下:
①制备的 DNA 片段存在其他 DNA 的污染,或者 KO 后缺失或者插入比较多长度,对于缺失或者插入 比较多的情况,单纯的 PCR 结束电泳检测即可肉眼分别出阳性,Cruiser®基因敲除检测错配酶酶切可再次验证阳性;
②根据酶切结果:若酶切后形成的各条带单一,则在 DNA 片段上可能含有其他杂交位点,需通过进一 步 DNA 测序检测;若形成的酶切条带数量远多于预期,且随机分布含一定弥散,则可能是 DNA 片段扩增 中,DNA 聚合酶错配扩增导致,更换高保真 DNA 聚合酶重新进行扩增可消除影响;
③如果 PCR 反应出现非特异性扩增的条带,也会导致同样情况,解决方案见 FAQ 中的 Q-1 中有杂带 的情况。


Q-6:酶切后,如何使电泳图酶切条带更亮?
A-6:为了改善酶切效果,使酶切出的条带更亮一点,通常采取以下措施:
①优先考虑改善杂交条件:杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下,有条件的可使用金属或水浴退火;
②适当增加酶切底物量,如 2μL 增加至 5μL,最多不超过 7μL(以 10μL 酶切体系不变)
④增加样品 DNA 浓度:PCR 反应再扩增一轮。


Q-7:Cruiser®基因敲除检测错配酶 检测结果是否会出现假阳性?
A-7:Cruiser®基因敲除检测错配酶是通过基因工程生产的 Cel I 同源核酸内切酶,具有更好的稳定性、高度的特异性 和高效性,它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源 DNA 双链。目前为止,尚未有文献报道使用Cruiser®基因敲除检测错配酶 或 Cel I 会出现假阳性。


Q-8.酶切后,电泳结果中酶切条带大小与预期一致,就一定是纯合子吗?
A-8:因为杂交的 DNA 片段是通过 PCR 得到的,所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切条带 后,不能 100%判断该样本为纯合子,因为杂合子也能得出同样的结果。因此,需要对 PCR 片段进行的 TA克隆和测序分析。



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